Genetik Toksisite Testleri

Genetik sistemler ile genotoksisitesi test edilmek istenen maddelerin karsinojenik ve mutajenik potansiyelleri arasında ilişki kurulmasını sağlayan bu testler şunlardır:
​

Ames testi kimyasal maddelerin mutajenik etkilerinin araştırılmasında kullanılan, test parametreleri açısından en iyi standardize edilmiş ve mutajen, karsinojen etkisi en iyi bilinen kimyasallarla geçerliliği en fazla kabul edilmiş bakteriyel test sistemlerinden biridir. Ayrıca hızlı, ucuz ve uygulanabilirliğinin kolay olması nedeniyle çok yaygın bir kullanım alanına sahiptir. Bu test, insanlarda ve deney hayvanlarında tümör oluşumunda somatik hücrelerin tümör baskılayıcı genlerinde meydana gelen nokta mutasyonların saptanmasında ve kimyasalların DNA ile etkileşimlerini önleyerek mutajenik ve karsinojenik etkilerini ortadan kaldıran antimutajenik ve antikarsinojenik maddelerin tayininde de sıklıkla kullanılmaktadır.
​

Comet tekniği, çeşitli ajanların yol açtığı DNA tek ve çift zincir kırıklarının tespiti için kullanılan hassas, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Tek hücre jel elektroforez tekniği olarak da adlandırılan Comet yöntemi, birçok memeli hücresinde çeşitli ajanların indüklediği DNA hasarı ve onarım bozukluğunun tayinini amaçlayan çalışmalarda kullanılmaktadır. DNA kırıklarının tayini prensibine dayanan bu yöntem, pek çok fiziksel ve kimyasal mutajenin özellikle insanlarda yol açtığı DNA hasarının tayininde, kanser hastalarında DNA hasarının derecesini ve tamirini tespit etmede, bazı kalıtsal hastalıkların prenatal tanısında, bazı hastalıklarda artmış DNA hasarını belirlemede kullanılan bir biyoizlem testidir. Ayrıca genotoksinleri ilk etki bölgelerde değerlendirebilmesi, hemen hemen tüm ökaryotik hücrelere uygulanabilmesi, düşük hasar seviyesini ölçebilmesi, az sayıda hücre örneği gerektirdiği için hızlı, basit ve ucuz bir yöntem olması gibi avantajlarından dolayı geniş bir kullanım alanına sahiptir.

​

Şekil 1. KA Testi
Kromozomal anormallikler DNA düzeyindeki hasarın bir sonucu olarak ortaya çıkmaktadır. Kromozom kırıkları DNA’daki onarılmamış çift zincir kırıklarından, yeni yapıya sahip kromozomlar ise DNA’daki zincir kırıklarının yanlış onarılmasından kaynaklanmaktadır. Genetik materyalde oluşan bu tip hasarlar tamir edilemediğinde ortaya çıkan yüksek KA frekansı ise, artmış kanser riskini göstermektedir. KA testi, mutajenler tarafından indüklenen çeşitli yapısal ve sayısal kromozomal anormalliklerin saptanması amacıyla sıklıkla kullanılan standart bir yöntemdir.

In vitro KA testi ile memeli hücre kültürlerinde, in vivo KA testi ile genellikle kemik iliği hücrelerinde kromozom anormalliği frekansı değerlendirilebilmektedir. Ayrıca in vivo KA testi, özellikle mutajenik hasarın belirlenmesinde türe ve dokuya göre değişebilen metabolizma, farmakokinetik ve DNA onarım mekanizmaları gibi faktörlerin değerlendirilmesine de olanak sağlamaktadır. In vitro memeli KA testinde, hücrelerin mitoz bölünme geçirmesini sağlayan ortamlarda, genellikle periferal kan lenfosit hücreleri inkübe edilmektedir. In vivo KA testinde ise genellikle hedef doku olarak vaskülarizasyonu fazla ve hızlı sirkülasyona sahip hücre populasyonu içeren kemik iliği kullanılmaktadır.
​

Şekil 2. KKD Testi
KKD, kardeş kromatitlerin homolog lokusları arasında DNA replikasyon ürünlerinin simetrik değişimidir ve DNA çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon yoluyla onarılmasını göstermektedir. Ayrıca KKD’ler nokta mutasyonların indüksiyonu, gen amplifikasyonu ve sitotoksisite ile yakından ilişkilidir. Bu test, çeşitli ajanların mutajenik ve karsinojenik etkilerinin, özellikle kromozomlarda oluşan yapısal değişimlerin araştırılmasında önemli bir yere sahiptir. Mutajen ve karsinojen olduğu bilinen maddelere maruz kalan hücrelerde ve kromozom kırılganlığı ve yatkınlığı ile karakterize edilen çeşitli kalıtsal hastalıklarda KKD frekansının arttığı ve artmış KKD frekansı ile tümör oluşumu arasında lineer bir ilişkinin olduğu saptanmıştır.


KKD testi ile özellikle DNA eklentileri oluşturan veya DNA replikasyonu ile etkileşime giren mutajen bileşikler saptanmaktadır. KKD testinde, DNA kırıklarını görünür hale getirmek için hücre kültürlerine DNA’da timin analoğu gibi davranan Bromodeoksiüridin (BrdU) maddesinin eklenmektedir ve bu maddenin hücre döngüsü sırasında kardeş kromatidlerin arasına girmesi sağlanarak homolog kromozomlardaki DNA parçalarının karşılıklı değişimi gösterilmektedir.


Kültürlerdeki hücreler çoğalırken DNA’ların replikasyonu sırasında yeni sentezlenen polinükleotid ipliğine ortamda bulunan BrdU içeren bromurasil nükleotidleri geçmektedir. Ultraviyole lambası ile ışınlanmaya maruz bırakıldığında DNA içine yerleşmiş olan BrdU daha açık renkte boyanmış bölgeler olarak görülmektedir. Kromatidlerin farklı boyanmasına neden olan bu boyanma farkı ile DNA’da kardeş kromatidler arasında oluşan değişimler gözlenebilmektedir.
​

MN’ler genellikle hücre siklusunu kontrol eden genlerdeki eksiklerden, mitotik iğdeki hatalardan, kinetokordan veya mitotik aygıtın diğer parçalarından ve kromozomal hasarlardan kaynaklanan, hücrenin mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmanlarından köken alan oluşumlardır. MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu kromozom düzensizliklerinin ve somatik hücrelerdeki genomik kararsızlığın indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Yapılan çalışmalarda, çeşitli fiziksel ve kimyasal ajanlara maruz kalan insanlarda, kanser ve genomik düzensizlik ile karakterize edilen çeşitli hastalıklarda MN frekansının önemli ölçüde yüksek olduğu bulunmuştur.


MN testi, mitoz ile oluşan tüm hücre tipleri üzerinde in vitro ve in vivo olarak uygulanabilmesi nedeniyle genetik toksikoloji araştırmalarında kullanılan yaygın bir test haline gelmiştir. Bu test ile genellikle kemik iliğinde veya periferal kan hücrelerindeki olgunlaşmamış (polikromatik) eritrositlerin MN oluşumu bakımından analizi yapılmakta ve test edilen bileşiğin genetik bir hasar oluşturup oluşturmadığı saptanmaktadır.
​

Genetik toksisite ya da genotoksisite testleri 1970’ lerden beri kullanılmaktadır ve günümüze kadar mutajenik ve genotoksik maddelerin karsinojenik potansiyellerini ölçebilmek için birçok genotoksisite testi geliştirilmiştir. Bu testler, çeşitli mekanizmalarla doğrudan ya da dolaylı olarak genetik materyalde meydana gelen hasarları saptamak amacıyla geliştirilmiş in vitro ve in vivo testlerden oluşurlar. Genotoksisite testleri ile mutajenlerin tanımlanması, insanda risk tayininin yapılması ve bu maddelere gereksiz maruz kalınmanın önlenmesi genetik toksikolojinin başlıca amaçlarını oluşturmaktadır. Genellikle kısa dönem mutajenite testleri tarama amaçlı kullanılırken, memeli testleri ise insanda risk tayini için kullanılmaktadır.

Genotoksisite testleri esas olarak genomu etkileyebilecek UV ve irradyasyon gibi fiziksel etkenlerin, parazitik enfeksiyonların, sigara, pestisitler, ilaçlar, gıda katkı maddeleri, nanomateryaller gibi birçok kimyasal ajanın genotoksik ve kanserojenik potansiyellerinin tespitinde, ilaçların hem piyasaya sürülmeden önce hem de ilaç kullanan kişilerdeki genetik etkilerini ve güvenirliliğini araştırmada, bazı hastalıklarda artmış DNA hasarının tespitinde, genetik hasar ile hastalıklar arasındaki ilişkinin belirlenmesinde, kanserden korunmada, kansere duyarlılığın tayininde ve takibinin yapılmasında biyoizlem testleri olarak kullanılmaktadır. Bileşiklerin genotoksik etkisinin saptanmasında tek bir testin tek başına yeterli olmadığı, bu nedenle bileşiklerin genotoksik ya da mutajenik aktivitesinin belirlenmesinde bir seri test sisteminin kullanılması gerektiği vurgulanmıştır.

​